新的小分子原料药有关物质分析方法开发思路探讨

前言


说到分析方法开发,目前国内大多数研究人员面对的都是仿制药的方法开发,也就是说有一定研究基础的方法微开发。已上市的仿制药或多或少都有一定的文献参考,比如各国药典、国内外研究文献、原研专利等等。这类方法的建立,大多基于已有的研究资料进行确认、优化,不能称为完整的方法开发。对于一个新的小分子原料药,没有可供参考的文献时,如何进行方法的开发呢?本文以有关物质方法开发为例,对新的小分子原料药的方法开发思路进行了简单的梳理,希望对大家有所启发。

理化性质研究

主要包括性状、晶型、熔点、溶解性、pKa、logP、引湿性、分子极性大小、BCS分类等


杂质谱分析


主要是根据合成路线来分析杂质谱,包括工艺杂质(中间体、副产物等)、残留溶剂(合成及精制过程用到的所有溶剂)、无机杂质(合成中用到的金属催化剂等),降解杂质(根据反应机理推断及强制降解研究来确定)。


个人认为杂质谱分析是一个很好的研究工具,因为研发是一个系统工程,需要统筹设计,就像QbD作为处方工艺开发的工具,指导我们研究的全面性,防止顾此失彼。在进行实验前,全面系统的杂质谱分析,可以让我们全面了解目标分析物,做到有的放矢。


残留溶剂和无机杂质方法开发相对比较清楚,这里不做探讨,主要阐述工艺杂质和降解杂质的有关物质分析方法的开发。


开发过程


稀释液的筛选


关键性能指标:对检测无干扰、溶解性好(溶解能力大于5倍目标溶解量)、溶液稳定(至少保证在分析检测时间段内是稳定的)、无溶剂化效应、经济环保等。先初筛再根据流动相考察情况调整,尽量选择和流动相组成接近的。


流动相、色谱柱、检测波长等关键色谱参数的筛选


关键性能指标:分离度好(主峰附近杂质同主峰能基线分离,分离度大于1.5;已知杂质之间能充分分离等)、主峰无杂质包裹(峰纯度符合要求)、无杂质未保留或未洗脱、已知杂质和未知杂质能准确定量、各目标分析物峰型及保留时间稳定、方法耐用性良好等。


如何做?主要基于理论和实践经验来设计。


1、流动相pH和缓冲盐  对于极性分子,pH通常选择pKa±1以外的区域,主要保障分子处在稳定的解离状态。缓冲盐根据目标分析物吸收波长情况和需要的缓冲范围来确定,比如对于低波长吸收的(220nm以下),优先基线噪音小的磷酸盐缓冲液,不选基线吸收大的有机缓冲盐。


2、流动相有机相种类  结合目标分析物的吸收波长、洗脱难易、选择性要求等,选择甲醇、乙腈、四氢呋喃或者它们的混合溶液。


3、色谱柱   色谱柱对选择性、分离度、峰型、保留时间等方面影响最大,选择合适的色谱柱对方法开发事半功倍。可以根据分子极性大小、分子结构特点,色谱柱本身的性能特点(比如载碳量、比表面积、是否封尾、封尾方式、适用pH范围、适用水相比例等),初步拟定色谱柱选择范围。先粗再细,并根据实验结果灵活调整。


4、检测波长  波长的选择影响到最终分析目标检测的准确性,所以需要认真评估。一般开发方法时会使用DAD,并采用200-400nm范围扫描,可以利用三维图谱选择主峰和杂质具有等吸收的波长(即相同浓度吸收接近的波长)。但目标分析物可能数量多,结构差异大,发色团不同,等吸收波长不容易统一,可能需要平衡方法策略,比如选择双波长、部分已知杂质采用校正因子或外标法定量等等。

方法开发的核心问题

是否有杂质漏检?分为以下几种可能情况,这里分别阐述。


1、杂质极性较大、保留弱,随溶剂峰一起洗脱


排查方法:降低洗脱强度,比如起始流动相减小有机相比例,观察是否有杂质多出;选择对极性保留强的色谱柱,比如waters T3色谱柱;如果方法兼容可以采用LCMS,通过质谱检测器来确认溶剂峰处是否有其它物质。


2、杂质包裹在主峰里面


排查方法:采用DAD检测器,考察峰纯度(对于杂质紫外吸收图谱同主峰接近的无法辨识);采用LCMS,利用质谱检测器检测主峰纯度(可信度高)。


3、杂质保留在色谱柱中未洗脱出来


排查方法:增大有机相比例和延长洗脱时间(增加洗脱强度),观察是否有新杂质。


4、杂质在选定波长下无紫外吸收


排查方法:采用DAD检测器在200-400nm范围检测,观察三维图谱是否存在新的杂质;采用LCMS,同时对比质谱图和紫外图,观察是否有新的杂质。

总结


以上是笔者对新分子原料药方法开发思路的一个简单梳理。实际操作中,目前仪器厂家,比如安捷伦和Waters公司都推出了专门用于分析方法开发的色谱系统,柱温箱可以同时兼容多根色谱柱,流动相系统可以在线混合调节不同pH,检测器配置了正交检测器(比如DAD和质谱检测器)。方法开发时可以同步筛选多根色谱柱和多个不同流动相。方法开发效率得到大幅度提升,并且仪器软件还会针对筛选的结果进行统计分析,给出最优的分离条件。优秀的硬件平台加上先进的设计理念,方法开发工作将变得更加高效、便捷。


作者介绍:代勇,2008年毕业于安徽大学化学系,从事药物研发分析行业多年。


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